Metoda badania
testDNA w testach na ojcostwo wykorzystuje metodę Multiplex STR, rekomendowaną przez Międzynarodowe Towarzystwo Genetyki Sądowej.
Jej zaletą jest możliwość wykonania badania z wykorzystaniem niewielkiej ilości DNA.
Po dostarczeniu próbek do laboratorium ewidencjonujemy je. Znaczy to, że zleceniu nadawany jest unikalny numer. Także każda próbka DNA otrzymuje swój numer (tzw. sample ID).
Administrując zleceniami, używamy specjalnego, zwalidowanego oprogramowania, zabezpieczającego przed nadaniem 2 razy takiego numeru próbki lub zlecenia.
Dzięki temu niemożliwa staje się zamiana próbek pomiędzy różnymi zleceniami. Co więcej, w naszym laboratorium ma miejsce kontrola pracy osoby wykonującej test przez drugiego pracownika.
Asystuje on w czasie kluczowych etapów badania oraz odpowiada za poprawne wykonanie zlecenia. Korzystanie z określonych procedur jest dla nas obowiązkiem.
Etapy laboratoryjne
Izolacja DNA
Próbki na początku są poddawane procesowi naruszającemu ściany komórkowe. Dzięki tej czynności można uzyskać DNA w czystej postaci.
Podczas izolacji DNA stosuje się specjalne odczynniki, inkubacje próbek w wyższej temperaturze, a także odwirowanie.
Amplifikacja DNA (reakcja PCR)
Kolejny etap ma na celu pozyskanie większej ilości DNA ze względu na to, że podczas izolacji DNA nie otrzymuje się wystarczającej ilości do dalszych badań.
Reakcja PCR polega na kopiowaniu DNA – niewielką ilość materiału genetycznego można zwielokrotnić do poziomu koniecznego do testu.
Podczas reakcji wykorzystuje się zdolność rozłączania dwuniciowej helisy do pojedynczych nici DNA. Do nich zostają przyłączone konieczne i odpowiednie startery i enzymy odbudowujące nić.
Ta reakcja jest przeprowadzana w termocyklerze.
Przed przystąpieniem do wykonania reakcji, konieczne jest jednak odpowiednie przygotowanie próbek w odpowiednich komorach laminarnych.
Pozwala to zapobiec kontaminacji, czyli zanieczyszczeniu.
Do DNA dodawana jest mieszanka specjalnych odczynników, która składa się m.in. ze znakowanych starterów (primerów), wolnych nukleotydów, enzymów polimerazy oraz buforów wspomagających cały proces.
Dwuniciowa helisa rozdziela się do pojedynczych nici po podwyższeniu temperatury w termocyklerze do 96oC. Proces ten nazywa się denaturacją DNA.
W temperaturze 59oC, kiedy DNA jest jednonociowe, przyłączają się do niego startery rozpoczynające odbudowę nici.
Do odbudowy, czyli jej wydłużania (elongacji), potrzebna jest temperatura 72oC oraz enzym polimerazy, który ułatwia połączenie się wolnym nukleotydom znajdującym się w spreparowanej wcześniej mieszance reakcyjnej.
Ten cykl powtarza się w termocyklerze ok. 30 razy.
Reakcja PCR to niezwykle delikatny proces. Ważne jest dobranie odpowiednich temperatur, właściwych odczynników, możliwości techniczne samego termocyklera oraz jakość próbki.
Podczas walidacji (potwierdzenia) gotowości naszej procedury badawczej do użycia jej do testów na ojcostwo zostały dokładnie przetestowane warunki reakcji i działanie termocyklera, aby zagwarantować Państwu poprawny jej przebieg.
Rozdział elektroforetyczny DNA
Ten etap testu realizuje się w urządzeniach nazywanych sekwenatorami.
Podczas elektroforezy cząsteczki DNA o ładunku ujemnym przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej. Elementy o różnych kształtach i wielkościach wędrują z różną prędkością.
Mniejsze fragmenty DNA migrują szybciej wzdłuż kapilary. Następnie ma miejsce detekcja fragmentów DNA przy użyciu lasera mieszczącego się w sekwenatorze.
Detekcję umożliwiają m.in. znakowane primery, które zostały dodane do próbki wcześniej. Podczas rozdziału elektroforetycznego primery te „świecą”. W tym momencie można ocenić jakość Państwa próbki.
Oprogramowanie Genemapper analizuje następnie dane z rozdziału, pozwalając na odczytanie wartości alleli w poszczególnych markerach.
Podczas obróbki danych w Genemapperze można zaobserwować już kompletne profile genetyczne osób, od których zostały próbki.
Analiza statystyczna
Dane ustalone po rozdziale elektroforetycznym wykorzystuje się do obliczenia prawdopodobieństwa ojcostwa w tym konkretnym przypadku.
To niezwykle ważny etap testu, który umożliwia ustalenie prawdopodobieństwa ojcostwa. Trzeba sprawdzić, czy jest ono na tyle wysokie, by móc wydać wynik graniczący z pewnością.
Zgodnie z zaleceniami Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii wiarygodnymi wynikami potwierdzającymi ojcostwo są takie, które mają ustalone prawdopodobieństwo na co najmniej 99,9999%.
Jeśli prawdopodobieństwo jest niższe niż 99,9999%, zaleca się najczęściej dołączenie do testu matki albo zwiększenie liczby badanych markerów.
W naszym laboratorium przeprowadza się analizę aż 24 markerów genetycznych, dlatego praktycznie zawsze osiąga się prawdopodobieństwo co najmniej 99,9999%.
Ma to miejsce nawet w sytuacji, w które bada się wyłącznie ojca i dziecko. Czytaj więcej >
Jeśli wynik testu wyklucza danego mężczyznę jako ojca biologicznego, badanie zostaje powtórzone jeszcze raz od początku. Wtedy test wykonuje się używając innej próbki, przeprowadza go też inny pracownik.
Wystawienie wyniku badania
Podczas wystawiania wyników używamy autorskiego oprogramowania.
Generuje ono automatycznie raport, co zdecydowanie minimalizuje ryzyko wystąpienia błędu ludzkiego.
Taki raport opracowują i autoryzują zawsze 2 osoby, które posiadają odpowiednie przeszkolenie i upoważnienie. Zobacz jakie informacje zawiera wynik badania >
Zobacz też:
